天津工生所在优化丁二酸细胞工厂方面取得系列进展,吡唑醚菌酯乳油对苹果斑点落叶病及轮纹病的毒力和田间药效试验

探讨天名精内酯酮对小麦全蚀病菌中的作用 发布时间:2019-04-15
点击查看>>药学硕士论文药学硕士论文范文第五篇:探讨天名精内酯酮对小麦全蚀病菌中的作用
摘 要
小麦全蚀病是由小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var. tritici
Walker)引起的一种分布较广、为害性较强的世界性病害,该病为一种土传病害,一旦发生较难根除。
天名精内酯酮是一种倍半萜内酯类化合物,广泛分布于菊科天名精属植物中,对小麦全蚀病菌具有显着抑制作用,具有进一步开发利用的价值,但该化合物对小麦全蚀病菌的抑菌机制尚不清楚。课题组前期经荧光示踪法、免疫荧光法以及免疫金法亚细胞定位等研究中发现天名精内酯酮在小麦全蚀病菌中作用的细胞器为线粒体,且对生物氧化有一定影响。本研究以小麦全蚀病菌为供试菌株,从组织病理学观测、生化与分子生物学水平研究以及同源模建与分子对接等手段对天名精内酯酮作用靶标进行初步鉴定。取得如下主要结果:
1、测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌的抑菌活性以及与线粒体呼吸链旁路呼吸酶抑制剂水杨肟酸的增效作用。结果表明:天名精内酯酮对小麦全蚀病菌有显着的抑制作用,EC50
为 40.30 ?g/mL.天名精内酯酮与 SHAM 的共毒系数为 146.1 显着大于
120,表明天名精内酯酮与 SHAM
有显着增效作用。因此,推测天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链有显着抑制作用。
2、测定天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链复合酶
I、II、III、IV、V、I+III、II+III以及柠檬酸合酶的浓度和时间效应,并通过实时荧光定量聚合酶链式反应分析了相关酶基因
mRNA
的相对表达量。结果表明:天名精内酯酮处理供试菌株后,呼吸链复合酶活性受到不同程度的抑制,尤其是复合酶
III、I+III 和 II+III. EC30、EC50 和 EC70
浓度处理下,天名精内酯酮可致供试菌株呼吸链复合酶 III 的活性分别降低了约
30%、60%、87%,复合酶 I+III 的活性分别降低了 26%、45%和 76%,复合酶 II+III
的活性分别降低了 50%、60%、85%.供试菌株呼吸链复合酶 III、I+III 和
II+III的活性与天名精内酯酮处理浓度和时间呈负相关;且线粒体呼吸链复合酶
III 基因 GgCyc对天名精内酯酮较为敏感。由此推测呼吸链复合酶 III
是天名精内酯酮潜在靶蛋白之一。
3、建立小麦全蚀病菌原生质体遗传转化体系,并将潮霉素磷酸转移酶基因转入供试菌株基因组
DNA 中。结果表明:小麦全蚀病菌产生原生质体较佳条件为:1
mL1.4%裂解酶中,0.035 g 菌丝在 31℃、90 rpm 酶解 2.2 h,产生的原生质体为
9.83 × 107原生质体/mL,原生质体活力达到 96.27%.在此条件下转化
hph,转化率为 46-54 个转化子/?g
DNA.小麦全蚀病菌原生质体遗传转化体系的建立为构建小麦全蚀病菌突变菌库奠定基础。
4、构建成功供试菌株呼吸链复合酶 III 基因 GgCytc1、GgCytb 和 GgIsp 的
RNAi
以及过表达突变菌株,并进一步测定了突变菌株菌丝生长速率、菌落形态以及对
H2O2 和天名精内酯酮的敏感性。结果表明:沉默突变菌株?GgCytc1、?GgCytb
和?GgIsp 的菌丝变细,端部分枝减少,菌丝生长速率较慢,对 H2O2
产生的氧化压敏感性有一定程度降低。沉默突变菌株?GgIsp
对天名精内酯酮的敏感性显着降低,EC50 为 156.18 ?g/mL,而过表达突变菌株
OEIsp 对天名精内酯酮较为敏感 EC50 为 25.88 ?g/mL.由此推测,复合酶 III
铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮潜在靶标之一。
5、测定野生型菌株及突变菌株的黑色素含量、过氧化物酶、漆酶、菌株致病性、离体和活体条件下呼吸链复合酶
III
活性以及线粒体氧消耗速率。结果表明:与野生型和过表达菌株相比,天名精内酯酮(100
?g/mL)处理后,沉默菌株?GgCytc1、?GgCytb、?GgIsp
以及天名精内酯酮抗性菌株 24-HN-1的黑色素含量显着增加(约
50-100%)。天名精内酯酮 EC80
处理后,野生型菌株及突变菌株的过氧化物酶活性显着增加,而?GgIsp
的过氧化物酶活性与对照相比无显着差异。?GgCytc1、?GgCytb、?GgIsp 和
24-HN-1 的漆酶活性显着降低(约 47,37,41 和
44%),其致病力较弱与漆酶活性一致。在离体条件下,用天名精内酯酮(0、EC20、EC80)处理后,除了?GgIsp
和 24-HN-1 呼吸链复合酶 III 活性并无显着变化,其余菌株呼吸链复合酶
III活性均显着降低;在活体条件下,天名精内酯酮 EC20 处理后,呼吸链复合酶
III 活性均有一定程度增加,EC80 处理后,复合酶 III
活性显着受到抑制,但是?GgIsp 和 24-HN-1呼吸链复合酶 III
活性变化并不显着。抗霉素
A处理菌株后,小麦全蚀病菌野生型菌株、?GgCytc1、?GgIsp、24-HN-1、OECytc1、OECytb
和 OEIsp 的线粒体氧消耗速率显着受到抑制(约 95、89、92、58、92、92 和
88%),而沉默突变菌株?GgCytb的线粒体氧消耗速率无明显变化;天名精内酯酮处理菌株后,小麦全蚀病菌野生型菌株、?GgCytc1、?GgCytb、24-HN-1、OECytc1、OECytb
和 OEIsp 的线粒体氧消耗速率显着受到抑制(约 81、77、78、58、72、73 和
70%),而沉默突变菌株?GgIsp的线粒体氧消耗速率无显着变化。由上述结果推测铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮的潜在靶标之一。
6、以酵母(Saccharomyces cerevisiae)呼吸链复合酶 III 细胞色素
c1,细胞色素 b和铁硫蛋白亚基的三维结构为模板,通过 SWISS-MODEL
软件对供试菌株 Cytc1、Cytb 和 ISP
亚基进行了同源模建以及活性腔预测,并将天名精内酯酮分别与 Cytc1、Cytb 和
ISP 亚基的活性腔进行分子对接。结果表明:Cytc1、Cytb和 ISP
亚基活性腔中的八个氨基酸残基(Tyr200、Arg194、Gly47、Gln43、Leu225、Arg171、Gln166
和 Tyr230)可能为天名精内酯酮的结合位点。
综上所述,天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链有显着抑制作用,且呼吸链复合酶
III
是其潜在的靶蛋白之一。结合课题组前期研究结果推测天名精内酯酮作用机制为:
天名精内酯酮在供试菌株线粒体中富集,影响呼吸链复合酶活性,尤其是复合酶
III,阻断呼吸链电子传递,致能量形成受阻,线粒体中积累大量
ROS,引起供试菌株一系列的氧化胁迫,最终线粒体释放凋亡因子,引起细胞凋亡而达到抑菌目的。
关键词:天名精内酯酮;小麦全蚀病菌;线粒体呼吸链;细胞色素
bc1复合体;RNAi美高梅4858官方网站 1

摘要
采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定了25%吡唑醚菌酯乳油对苹果斑点落叶病病菌和苹果轮纹病病菌的毒力,并进行了田间药效试验。结果表明,25%吡唑醚菌酯乳油对苹果斑点落叶病病菌菌丝生长和孢子萌发的EC50分别为0.1763、0.2755μg/mL;对苹果轮纹病病菌菌丝生长和孢子萌发的EC50分别为0.0333、0.6029μg/mL;第4次施药后16天,25%吡唑醚菌酯乳油1500、2000、2500倍液对苹果斑点落叶病的防效为96.72%~98.69%,采收后30天对苹果轮纹病的防效为93.17%~99.15%,显著或明显好于43%戊唑醇悬浮剂3000倍液和80%代森锰锌可湿性粉剂700倍液。

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关键词 吡唑醚菌酯 苹果 苹果斑点落叶病 苹果轮纹病 毒力 防治效果

丁二酸是一种优秀的平台化合物,在化工、材料、医药、食品领域有着广泛的用途,被美国能源部列为未来12种最有价值的平台化合物之一。作为C4平台化合物,丁二酸可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯以及生物可降解材料聚丁二酸丁二醇酯。构建高效生产丁二酸的微生物细胞工厂,将可再生的生物质资源高效转化为丁二酸,是近年来国际上的研究热点。糖酸转化率和耐渗透胁迫是丁二酸细胞工厂改造的两个重要方面。

苹果斑点落叶病和苹果轮纹病是苹果生产上的2种主要病害。苹果斑点落叶病主要为害苹果树叶片,造成前期大量落叶,而苹果轮纹病可为害枝干和果实,导致枝干粗皮和果实腐烂,严重影响苹果的质量和产量。目前,对苹果斑点落叶病和苹果轮纹病的防治主要以化学药剂为主,生产上多使用多抗霉素、异菌脲、苯醚甲环唑等药剂防治苹果斑点落叶病,使用戊唑醇、代森锰锌、多菌灵等药剂防治苹果轮纹病。由于常年使用这些药剂,导致苹果斑点落叶病和苹果轮纹病对这些药剂已逐渐产生抗药性,为此,探寻新的化学药剂十分重要。25%吡唑醚菌酯乳油为最新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂,具有活性高、杀菌谱广、持效期长和耐雨水冲刷的特点。该药剂在国内针对西瓜、香蕉和黄瓜等作物病害已取得登记,然而,在苹果斑点落叶病和苹果轮纹病上的应用尚未见报道。为了探明该药剂对苹果斑点落叶病和苹果轮纹病的防治效果,我们于2011年测定了25%吡唑醚菌酯乳油对苹果斑点落叶病病菌和苹果轮纹病病菌的室内毒力和田间防效,取得了较好的防治效果,现将结果报道如下。

中国科学院天津工业生物技术研究所研究员张学礼带领的微生物代谢工程研究团队经前期研究表明,使用C5磷酸戊糖途径替代C6糖酵解途径,能提高葡萄糖代谢的还原力供给,解决丁二酸合成途径中的还原力不平衡问题。通过增强磷酸戊糖途径中的转酮酶活性,并结合转氢酶的激活,可以将丁二酸的糖酸转化率从1.1提高到1.3
mol/mol。在此基础上,进一步对大肠杆菌的磷酸戊糖途径进行了系统改造。通过使用启动子文库对磷酸戊糖途径7个基因进行精确调控,解析了各个蛋白活性和丁二酸转化率之间的相互关系。研究发现,5-磷酸核糖异构酶和5-磷酸核酮糖异构酶是途径中的两个关键调控靶点,这两个酶活性的增强会导致中间代谢物的不平衡,降低丁二酸的生产;其余5个蛋白活性在一定范围内和丁二酸转化率呈正相关关系。在此基础上,将磷酸戊糖途径分为三个模块,并使用多维度模块化代谢工程的策略对磷酸戊糖途径进行系统改造。最终,研究人员将丁二酸的转化率提高到1.61
mol/mol,达到理论最大值的94%。相关研究成果发表在Biotechnology for
Biofuels期刊上,天津工生所的博士研究生谭在高和陈晶为论文的共同第一作者。

1 材料与方法

另一方面,研究团队前期获得一个高效的丁二酸细胞工厂HX024,该菌具有很强的耐渗透胁迫能力。在此基础上,通过基因组重测序和反向代谢工程验证,发现两个关键蛋白CusS和RpoB的突变与菌株的耐渗透胁迫相关,并进一步解析了其机理。Cu是细菌生长必不可少的微量金属离子,然而,Cu对Fe-S簇生物合成机器和含Fe-S簇的重要代谢酶具有很大的破坏性,导致细胞在生理和代谢层次的全局紊乱。高渗透胁迫造成胞内Cu激活了cusCFBA基因簇的表达,使得细胞能更有效地外排Cu,从而表现出更强的耐渗透胁迫能力。另外,通过外源添加Cu螯合剂甲硫氨酸或半胱氨酸,也能提高大肠杆菌的耐渗透胁迫能力。该研究首次发现含硫氨基酸可作为厌氧条件下的耐渗透保护物质。相关研究成果发表在Applied
and Environmental
Microbiology期刊上,天津工生所博士研究生肖孟雍为论文的第一作者。

1.1室内毒力测定

基因rpoB编码RNA聚合酶的β亚基,该基因突变会导致细胞的全局调控。研究发现,RpoB突变导致在正常渗透压条件下,谷氨酸代谢合成、渗透保护物质转运系统ProU等与耐渗透胁迫相关的基因被激活,从而使大肠杆菌获得了“预先应对”机制,有利于细胞应对即将到来的高渗透胁迫。在高渗条件下,该突变激活了一系列糖转运蛋白,其中麦芽糖ABC转运系统相关基因malEFGKM和lamB的表达水平提高最显着。进一步研究发现,高渗胁迫下增强葡萄糖的转运可增强细胞的耐高渗能力。相关研究成果发表在BMC
Biotechnology期刊上,天津工生所博士研究生肖孟雍为论文的第一作者。

1.1.1供试材料

上述研究得到国家自然科学基金、973计划和中科院重点部署项目的支持。

供试药剂为25%吡唑醚菌酯乳油(德国巴斯夫股份有限公司),对照药剂为43%戊唑醇悬浮剂(上海禾本药业有限公司)、80%代森锰锌可湿性粉剂(南通德斯益农化工有限公司)。苹果斑点落叶病病菌(Alternaria
mali)和苹果轮纹病病菌(Botryosphaeria
berengeriana)均由本实验室分离培养,在PDA斜面上于4℃冰箱中保存。

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1.1.2毒力测定方法

多维度模块化代谢工程改造磷酸戊糖途径提高丁二酸转化率

菌丝生长速率法
将供试药剂稀释成5个系列质量浓度,在无菌操作条件下,吸取1mL药液加入到融化的99mL灭菌PDA培养基中,充分摇匀,然后等量倒入培养皿中,制成相应浓度的含药平板。以不含药剂的处理作空白对照,每个处理4次重复。将培养好的病原菌用直径6mm的打孔器自菌落边缘切取菌饼,用接种针将菌饼接种于含药平板中央,菌丝面朝上,盖上皿盖,置于25℃恒温培养箱培养,待空白对照的菌落快要长满培养皿时,用十字交叉法测量各处理菌落直径。计算菌落扩展直径及菌丝生长抑制率,求出药剂的毒力回归方程、EC50值。

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菌丝生长抑制率=[1-(处理菌落直径-菌饼直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100

Cus系统提高菌株耐渗透胁迫示意图

孢子萌发法
取9mL水琼脂与系列浓度的药剂在锥形瓶内充分混合,倒入培养皿中制成含药平板,待培养基完全凝固后,用直径6mm的打孔器在水琼脂平板不同直径的同心圆上打取6个含药琼脂片,将其放在载玻片上,取25μL孢子悬浮液涂在琼脂片上,25℃黑暗保湿培养,当对照的孢子萌发率在90%以上时检查各处理孢子萌发情况。计算孢子萌发相对抑制率,求出药剂的毒力回归方程、EC50值。

处理校正孢子萌发率=(处理孢子萌发率/空白对照孢子萌发率)×100

孢子萌发相对抑菌率=[(空白对照孢子萌发率-处理校正的孢子萌发率)/空白对照孢子萌发率]×100

1.2田间药效试验

1.2.1试验园概况

试验地点位于河北省清苑县温仁镇温仁村。苹果品种为短枝富士,树龄7年生,行株距为5m×5m,试验树共36株,常规管理,历年来均有苹果斑点落叶病和苹果轮纹病发生。

1.2.2试验设计

试验共设6个处理:25%吡唑醚菌酯乳油1500、2000、2500倍液,43%戊唑醇悬浮剂3000倍液、80%代森锰锌可湿性粉剂700倍液,对照喷清水。小区随机排列,每小区2株树,重复3次。于2011年6月15日开始施药,每隔15~20天施1次药,共施5次药,喷药当天晴或多云,每株树喷洒药液4L。

1.2.3调查方法

苹果斑点落叶病
2011年6月15日第1次施药时调查发病基数为零。于2011年9月4日即第3次施药后24天(第4次施药前,期间有降雨,施药间隔期延长)、9月20日即第4次施药后16天分别调查1次发病情况,按分级标准记载并计算病情指数和防治效果。

病叶率=(病叶数/调查总叶数)×100

病情指数=[∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×最高病级值)]×100

防治效果=[(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数]×100

苹果轮纹病
2011年10月24日(第5次施药后30天)果实近成熟期调查树上、树下的总果数和苹果轮纹病病果数并采果,每株树分上、中、下3层,从东、西、南、北、中5个方位随机采摘35个果,每小区共采70个果,装入纸箱中,室内常温下存放,于采收后15、30天后再各调查1次,统计病果率和防治效果。

病果率=(病果数/调查总果数)×100

防治效果=[(对照区病果率-处理区病果率)/对照区病果率]×1002 结果与分析

2.1室内毒力测定

美高梅4858官方网站,25%吡唑醚菌酯乳油对苹果斑点落叶病和苹果轮纹病病菌菌丝生长均具有较强的抑制活性,EC50分别为0.1763、0.0333μg/mL;抑菌率均高于80%代森锰锌可湿性粉剂和43%戊唑醇悬浮剂。

25%吡唑醚菌酯乳油对苹果斑点落叶病和苹果轮纹病病菌孢子萌发均具有较强的抑制活性,EC50分别为0.2755、0.6029μg/mL,均与80%代森锰锌可湿性粉剂相当,明显好于43%戊唑醇悬浮剂。

2.2田间药效试验

25%吡唑醚菌酯乳油对苹果斑点落叶病具有较好的防治效果。第3次施药后24天和第4次施药后16天2次调查,25%吡唑醚菌酯乳油1500、2000、2500倍液处理的防效均显著高于对照药剂43%戊唑醇悬浮剂3000倍液和80%代森锰锌可湿性粉剂700倍液。

25%吡唑醚菌酯乳油对苹果轮纹病也有较好的防治效果,且对苹果树安全、无药害。近采收时(第5次施药后30天),25%吡唑醚菌酯乳油1500、2000、2500倍液处理的防效为90.73%~96.36%,采收后贮藏15天的防效为96.34%~98.80%,采收后贮藏30天时防效为93.17%~99.15%,均显著高于80%代森锰锌可湿性粉剂700倍液,明显高于对照药剂43%戊唑醇悬浮剂3000倍液。

3 小结与讨论

本研究采用室内毒力测定与田间药效试验相结合的方法,测试了25%吡唑醚菌酯乳油对苹果斑点落叶病和苹果轮纹病的防治效果。室内毒力测定与田间药效试验结果基本相符,室内表现抑菌效果较好的25%吡唑醚菌酯乳油在田间防效最高,其防效均在90%以上,显著或明显优于常规对照药剂43%戊唑醇悬浮剂和80%代森锰锌可湿性粉剂。在田间试验过程中,该药剂在试验浓度条件下对苹果树安全,无药害发生。因此,25%吡唑醚菌酯乳油有望成为将来生产上防控苹果斑点落叶病和苹果轮纹病的首选药剂。

25%吡唑醚菌酯乳油为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂,其作用机制为线粒体呼吸抑制剂,目前尚未检测到苹果斑点落叶病病菌和苹果轮纹病病菌对25%吡唑醚菌酯乳油的抗药菌株。但由于2种病原菌田间菌量较大,且该药剂为内吸性杀菌剂,在较强的药剂选择压下易产生对该药剂的抗药性,因此建议将25%吡唑醚菌酯乳油与80%代森锰锌可湿性粉剂等保护性药剂及43%戊唑醇悬浮剂等内吸性药剂交替使用或混用。建议采用以下施药技术:在苹果斑点落叶病和苹果轮纹病发病前,喷施80%代森锰锌可湿性粉剂700倍液等保护剂,间隔期15~20天;轻微发病时,喷施43%戊唑醇悬浮剂3000倍液等内吸剂,间隔期15~20天;发病严重时,喷施25%吡唑醚菌酯乳油2500倍液,间隔期可缩短到10~15天。

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